前言
本標準代替GB5009.5—2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》、GB/T14889.2—2008《糧油檢驗植物油料粗蛋白質的測定》、GB/T15673—2009《食用菌中粗蛋白質含量的測定》、GB/T5511—2008《谷物和豆類氮含量測定和粗蛋白質含量計算凱氏法》、GB/T9695.11—2008《肉與肉制品氮含量測定》和GB/T9832—2008《糧油檢驗植物油料餅粕含氮量的測定》。本標準與GB5009.5—2010相比，
主要變化如下：——增加附錄A蛋白質折算系數。
1范圍
本標準規定了食品中蛋白質的測定方法。
本標準第一法和第二法適用于各種食品中蛋白質的測定，第三法適用于蛋白質含量在10g/100g以上的糧食、豆類奶粉、米粉、蛋白質粉等固體試樣的測定。
本標準不適用于添加無機含氮物質、有機非蛋白質含氮物質的食品的測定。
第一法凱氏定氮法
2原理食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨。堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定，根據酸的消耗量計算氮含量，再乘以換算系數，即為蛋白質的含量。
3試劑和材料
3.1試劑
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的三級水。
3.1.1硫酸銅（CuSO?·5H?O）。
3.1.2硫酸鉀（K?SO?）。
3.1.3硫酸（H?SO?）。
3.1.4硼酸（H?BO?）。
3.1.5甲基紅指示劑（C??H??N?O?）。
3.1.6溴甲酚綠指示劑（C??H??Br?O?S）。
3.1.7亞甲基藍指示劑（C??H??ClN?S·3H?O）。
3.1.8氫氧化鈉（NaOH）。
3.1.9 95%乙醇（C?H?OH）。
3.2試劑配制
3.2.1硼酸溶液（20g/L）：稱取20g硼酸，加水溶解后并稀釋至1000mL。
3.2.2氫氧化鈉溶液（400g/L）：稱取40g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100mL。
3.2.3硫酸標準滴定溶液[c（1/2H?SO?）]0.0500mol/L或鹽酸標準滴定溶液[c（HCl）]0.0500mol/L。
3.2.4甲基紅乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。
3.2.5亞甲基藍乙醇溶液（1g/L）：稱取0.1g亞甲基藍，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100mL。
3.2.6 溴甲酚綠乙醇溶液（1 g/L）：稱取0.1 g溴甲酚綠，溶于95 %乙醇，用95 %乙醇稀釋至100 mL。
3.2.7 A混合指示液：2份甲基紅乙醇溶液與1份亞甲基藍乙醇溶液臨用時混合。
3.2.8 B混合指示液：1份甲基紅乙醇溶液與5份溴甲酚綠乙醇溶液臨用時混合。
4 儀器和設備
4.1 天平：感量為1 mg。
4.2 定氮蒸餾裝置：如圖1所示。
4.3 自動凱氏定氮儀。
說明：
1——電爐；
2——水蒸氣發生器（2 L燒瓶）；
3——螺旋夾；
4——小玻杯及棒狀玻塞；
5——反應室；
6——反應室外層；
7——橡皮管及螺旋夾；
8——冷凝管；
9——蒸餾液接收瓶。
圖1 定氮蒸餾裝置圖
5 分析步驟
5.1 凱氏定氮法
5 分析步驟
5.1 凱氏定氮法
5.1.1 試樣處理：稱取充分混勻的固體試樣0.2 g～2 g、半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當于30 mg～40 mg氮），精確至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL或500 mL定氮瓶中，加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸，輕搖后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網上。小心加熱，待內容物全部碳化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色并澄清透明后，再繼續加熱0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入20 mL水。放冷后，移入100 mL容量瓶中，并用少量水洗滌定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。
5.1.2 測定：按圖1裝好定氮蒸餾裝置，向水蒸氣發生器內裝水至2/3處，加入數粒玻璃珠，加甲基紅乙醇溶液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發生器內的水并保持沸騰。
5.1.3 向接收瓶內加入10.0 mL硼酸溶液及1滴～2滴混合指示液（B）并保持滿瓶，并使冷凝管的 下端插入液面下，根據試樣中氮含量，準確吸取2.0 mL～10.0 mL試樣處理液由小玻杯注入反應室，以10 mL水洗滌小玻杯并使之流入反應室內，隨后塞緊棒狀玻塞。將10.0 mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，立即將玻塞蓋緊，并加水封。夾緊螺旋夾，開始蒸餾。蒸餾10 min 后移動蒸餾液接收瓶，液面離開冷凝管下端，再蒸餾1 min。然后用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下蒸餾液接收瓶。以硫酸或鹽酸標準滴定溶液滴定至終點，如用A混合指示液，終點顏色為灰藍色；如用B混合指示液，終點顏色為淺紅色。同時做試劑空白。
5.2 自動凱氏定氮儀法
稱取充分混勻的固體試樣0.2 g～2 g、半固體試樣2 g～5 g或液體試樣10 g～25 g（約相當于30 mg～40 mg氮），精確至0.001 g，至消化管中，再加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420℃后，繼續消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50 mL水，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標準溶液以及含有混合指示劑A或B的硼酸溶液）上實現自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據的過程。
6 分析結果的表述
試樣中蛋白質的含量按式(1)計算：
式中：
X——試樣中蛋白質的含量，單位為克每百克（g/100g）；
V?——試液消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，單位為毫升（mL）；
V?——試劑空白消耗硫酸或鹽酸標準滴定液的體積，單位為毫升（mL）；
c——硫酸或鹽酸標準滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；
0.0140——1.0 mL硫酸[c（\(\frac{1}{2}\)H?SO?） = 1.000 mol/L]或鹽酸[c（HCl） = 1.000 mol/L]標準滴定溶液相當的氮的質量，單位為克（g）；
m——試樣的質量，單位為克（g）；
V?——吸取消化液的體積，單位為毫升（mL）；
F——氮換算為蛋白質的系數，各種食品中氮轉換系數見附錄A；
100——換算系數。
蛋白質含量≥1 g/100 g時，結果保留三位有效數字；蛋白質含量＜1 g/100 g時，結果保留兩位有效數字。
注：當只檢測氮含量時，不需要乘蛋白質換算系數F。
7 精密度
在重復條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
第二法 分光光度法
8 原理
食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH 4.8的乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色的 3,5 - 二乙酰 - 2,6 - 二甲基 - 1,4 - 二氫化吡啶化合物。在波長 400 nm 下測定吸光度值，與標準系列比較定量，結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。
9 試劑和材料
9.1 試劑
除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規定的三級水。
9.1.1 硫酸銅（CuSO?·5H?O）。
9.1.2 硫酸鉀（K?SO?）。
9.1.3 硫酸（H?SO?）：優級純。
9.1.4 氫氧化鈉（NaOH）。
9.1.5 對硝基苯酚（C?H?NO?）。
9.1.6 乙酸鈉（CH?COONa·3H?O）。
9.1.7 無水乙酸鈉（CH?COONa）。
9.1.8 乙酸（CH?COOH）：優級純。
9.1.9 37%甲醛（HCHO）。
9.1.10 乙酰丙酮（C?H?O?）。9.2 試劑配制
9.2.1 氫氧化鈉溶液（300 g/L）：稱取30 g氫氧化鈉加水溶解后，放冷，并稀釋至100 mL。
9.2.2 對硝基苯酚指示劑溶液（1 g/L）：稱取0.1 g對硝基苯酚指示劑溶于20 mL 95 %乙醇中，加水稀釋至100 mL。
9.2.3 乙酸溶液（1 mol/L）：量取5.8 mL乙酸，加水稀釋至100 mL。
9.2.4 乙酸鈉溶液（1 mol/L）：稱取41 g無水乙酸鈉或68 g乙酸鈉，加水溶解稀釋至500 mL。
9.2.5 乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液：量取60 mL乙酸鈉溶液與40 mL乙酸溶液混合，該溶液pH 4.8。
9.2.6 顯色劑：15 mL甲醛與7.8 mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100 mL，劇烈振搖混勻（室溫下放置穩定3d）。
9.2.7 氨氮標準儲備溶液（以氮計）（1.0 g/L）：稱取105℃干燥2 h的硫酸銨0.472 0 g加水溶解后移于100 mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻，此溶液每毫升相當于1.0 mg氮。
9.2.8 氨氮標準使用溶液（0.1 g/L）：用移液管吸取10.00 mL氨氮標準儲備液于100 mL容量瓶內，加水定容至刻度，混勻，此溶液每毫升相當于0.1 mg氮。
10 儀器和設備
10.1 分光光度計。
10.2 電熱恒溫水浴鍋：100℃±0.5℃。
10.3 10 mL具塞玻璃比色管。
10.4 天平：感量為1 mg。
11 分析步驟
11.1 試樣消解
稱取充分混勻的固體試樣0.1 g～0.5 g（精確至0.001 g）、半固體試樣0.2 g～1 g（精確至0.001 g）
或液體試樣1 g～5 g（精確至0.001 g），移入干燥的100 mL或250 mL定氮瓶中，加入0.1 g硫酸銅、1 g硫酸鉀及5 mL硫酸，搖勻后于瓶口放一小漏斗，將定氮瓶以45°角斜支于有小孔的石棉網上。緩慢加熱，待內容物全部炭化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續加熱0.5 h。取下放冷，慢慢加入20 mL水，放冷后移入50 mL或100 mL容量瓶中，并用少量水洗滌定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。按同一方法做試劑空白試驗。
11.2 試樣溶液的制備
吸取2.00 mL～5.00 mL試樣或試劑空白消化液于50 mL或100 mL容量瓶內，加1滴～2滴對硝基苯酚指示劑溶液，搖勻后滴加氫氧化鈉溶液中和至黃色，再滴加乙酸溶液至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。
11.3 標準曲線的繪制
吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL和1.00 mL氨氮標準使用溶液（相當于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg和100.0 μg氮），分別置于10 mL比色管中。加4.00 mL乙酸鈉 - 乙酸緩沖溶液及4.00 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內，以零管為參比，于波長400 nm處測量吸光度值，根據標準各點吸光度值繪制標準曲線或計算線性回歸方程。
11.4 試樣測定
吸取0.50 mL～2.00 mL（約相當于氮＜100 μg）試樣溶液和同量的試劑空白溶液，分別于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸鈉 - 乙酸緩沖液及4.0 mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻。置于100℃水浴中加熱15 min。取出用水冷卻至室溫后，移入1 cm比色杯內，以零管為參比，于波長400 nm處測量吸光度值，試樣吸光度值與標準曲線比較定量或代入線性回歸方程求出含量。
12 分析結果的表述
試樣中蛋白質的含量按式(2)計算：
式中：
X——試樣中蛋白質的含量，單位為克每百克（g/100g）；
C——試樣測定液中氮的含量，單位為微克（μg）；
C?——試劑空白測定液中氮的含量，單位為微克（μg）；
V?——試樣消化液定容體積，單位為毫升（mL）；
V?——試樣溶液總體積，單位為毫升（mL）；
m——試樣質量，單位為克（g）；
V?——制備試樣溶液的消化液體積，單位為毫升（mL）；
V?——測定用試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；
1000——換算系數；
100——換算系數；
F——氮換算為蛋白質的系數。
蛋白質含量≥1g/100g時，結果保留三位有效數字；蛋白質含量＜1g/100g時，結果保留兩位有效數字。
13 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
第三法 燃燒法
14 原理
試樣在900℃～1 200℃高溫下燃燒，燃燒過程中產生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮氣，形成的氮氣流通過熱導檢測器（TCD）進行檢測。
15 儀器和設備
15.1 氮/蛋白質分析儀。
15.2 天平：感量為0.1 mg。
16 分析步驟
按照儀器說明書要求稱取0.1 g～1.0 g充分混勻的試樣（精確至0.000 1 g），用錫箔包裹后置于樣品盤上。試樣進入燃燒反應爐（900℃～1200℃）后，在高純氧（≥99.99%）中充分燃燒。燃燒爐中的產物（NO?）被載氣二氧化碳或氦氣運送至還原爐（800℃）中，經還原生成氮氣后檢測其含量。
17 分析結果的表述
試樣中蛋白質的含量按式(3)計算：
式中：
X——試樣中蛋白質的含量，單位為克每百克（g/100g）；
C——試樣中氮的含量，單位為克每百克（g/100g）；
F——氮換算為蛋白質的系數。
結果保留三位有效數字。
18 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
19 其他
本方法第一法當稱樣量為5.0 g時，檢出限為8 mg/100 g。
本方法第二法當稱樣量為5.0 g時，檢出限為0.1 mg/100 g。
附 錄 A
常見食物中的氮折算成蛋白質的折算系數
常見食物中的氮折算成蛋白質的折算系數見表 A.1。
表A.1 蛋白質折算系數表
粵公網安備 44011202000628號 粵ICP備14047970號
